Miért vált ki véralvadást anyatej?

Módszerek

Az emberi tej gyűjtése és előkészítése

Az emberi tejet 6 egészséges, szoptató felnőtt nőtől gyűjtöttük (átlagéletkor 33 év; tartomány 30-39 év), a Bécsi Orvosi Egyetem Etikai Bizottságának jóváhagyásával (#1721/2015). A vizsgálatba való bekerülési kritériumoknak megfelelően minden résztvevő egészséges, teljesen kifejlett csecsemőt szült, és a csecsemők legalább 6 hétig szoptattak (medián, 115 nap; tartomány, 63-225 nap). A tejet reggel ∼2 órával az előző szoptatás után gyűjtötték kézi mellszívóval (SCF330/20 pumpa; Philips Avent, Glemsford, Egyesült Királyság). A tejet atraumatikusan, alacsony nyomású kézi pumpával gyűjtöttük. Az atraumatikus tejgyűjtés biztosítása érdekében minden donort megkértünk, hogy számoljon be bármilyen fájdalomról vagy kellemetlenségről a tejgyűjtés alatt vagy után (egyetlen donor sem számolt be erről). Legalább 10 ml tejet gyűjtöttek steril polietilén gyűjtőcsövekbe. A begyűjtött tejet szobahőmérsékleten tartottuk, és a gyűjtést követő 30 percen belül kétszer 3000 g-nél (Rotanta 460R; Hettich, Tuttlingen, Németország) 10 percig centrifugáltuk. Minden egyes centrifugálás után a felülúszó zsírt lefölöztük, és a pelletet eldobtuk a sejtek eltávolítása érdekében a korábban leírtak szerint.
Az aliquotokat a mérések elvégzéséig -80°C-on tároltuk.

EV-k izolálása emberi tejből 

A tejet 37°C-os vízfürdőben olvasztottuk fel. Egyes kísérletekhez a tejet 154 000 g-n (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) 1 órán keresztül 4°C-on centrifugáltuk. A centrifugálás után a felülúszót új csőbe töltöttük, és a pelletet az eredeti térfogatban pufferben reszuszpendáltuk. Alternatívaként a tejet Sepharose CL-2B (GE Health Care, Pittsburgh, PA) méret-kiválasztásos kromatográfiás (SEC) Telos oszlopon (15 ml; Kinesis, Vernon Hills, IL) frakcionáltuk az EV-k izolálása érdekében a korábban leírtak szerint. Röviden, 500 µL emberi tejet 37°C-os vízfürdőben felolvasztottunk, és 500 µL sóoldattal hígítottuk, mielőtt a SEC-oszlopra töltöttük.
Összesen 26, egyenként 0,5 ml-es frakciót gyűjtöttünk. Mivel a SEC hatékonyan választja el az EV-ket az oldható fehérjéktől, az EV-tartalmú csúcsfrakciók fehérjekoncentrációja nagyon alacsony volt. Ezért az egyes SEC-frakciókban lévő összes fehérjét triklór-ecetsavval kicsaptuk, és 10 percig 21 000 g-nél pelletáltuk, majd a pelleteket 20 μL foszfát-pufferelt sóoldatban reszuszpendáltuk. A pH-t minden frakcióban ∼7,0-ra állítottuk be, és a fehérjéket redukáló mintapufferben oldottuk fel a kiegészítő Módszerek című fejezetben leírtak szerint. A SEC-frakciók teljes fehérjetartalmának blotra helyezésével a korábban leírtak szerint összehasonlítható a frakciók között az érdeklődésre számot tartó fehérje abszolút jelenléte. A CD63 és a CD9 egyaránt a kimutatási határ alatt volt a tejben, a kiindulási anyagban (2A-B ábra), míg a TF egyértelműen kimutatható volt (3A ábra). A felülúszót és a reszuszpendált pelletet a SEC-frakciókkal együtt áramlási citometriához, felületi plazmon-rezonancia képalkotáshoz, Western blothoz, illetve alvadási vizsgálathoz használtuk.  

Alvadási próba

A tej vagy annak frakciói alvadási potenciáljának meghatározására a korábban leírtak szerint alvadási vizsgálatot végeztünk.  Az EV-mentesített plazmát úgy állítottuk elő, hogy citrált humán összevont normál plazmát 18 890 g-nél 20°C-on 1 órán át centrifugáltunk. A tejet pufferben (teljes térfogat 20 µl) 1%-os végső koncentrációra hígítottuk a legtöbb kísérletben (kivéve azokat, amelyekben a tejet SEC-vel frakcionáltuk), és 70 μl EV-mentesített, összevont normál plazmához adtuk anti-TF (HTF-1 klón; eBiosciences, San Diego, CA; végső koncentráció 30 μg/ml) vagy anélkül. Az elegyet 37°C-on inkubáltuk 5 percig. A véralvadást 15 µl kalcium-klorid (100 mmol/l alapanyag) hozzáadásával indítottuk el. A fibrinképződést (azaz a vérrögképződést) 1 órán keresztül 37°C-on követtük nyomon a 405 nm-es hullámhosszon mért optikai sűrűség mérésével SpectraMax i3 mikrolemezdetektorral (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Kiegészítő módszerek

A kriogén elektronmikroszkópiát (cryo-EM), az áramlási citometriát, a felületi plazmon-rezonancia képalkotást, a Western blot analízist, az emberi tej in vitro emésztési modelljeit, a szarvasmarha tej és szarvasmarha plazma gyűjtési eljárásokat, az emberi tej gyűjtési eljárásokat, valamint a koraszülöttek és az újszülött intenzív osztályon szoptató anyák klinikai jellemzőit leíró részletes módszereket a kiegészítő módszerek tartalmazzák.

Statisztika

Az adatokat 2-tailed Student t-teszttel elemeztük (SPSS szoftver, 25.0 verzió; SPSS, Inc., Chicago, IL). A <,05 valószínűségi értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A folytonos változókat átlag ± az átlag standard hibája értékben tüntettük fel, hacsak másképp nem szerepel.

Alvadási próba

A tej vagy annak frakciói alvadási potenciáljának meghatározására a korábban leírtak szerint alvadási vizsgálatot végeztünk.  Az EV-mentesített plazmát úgy állítottuk elő, hogy citrált humán összevont normál plazmát 18 890 g-nél 20°C-on 1 órán át centrifugáltunk. A tejet pufferben (teljes térfogat 20 µl) 1%-os végső koncentrációra hígítottuk a legtöbb kísérletben (kivéve azokat, amelyekben a tejet SEC-vel frakcionáltuk), és 70 μl EV-mentesített, összevont normál plazmához adtuk anti-TF (HTF-1 klón; eBiosciences, San Diego, CA; végső koncentráció 30 μg/ml) vagy anélkül. Az elegyet 37°C-on inkubáltuk 5 percig. A véralvadást 15 µl kalcium-klorid (100 mmol/l alapanyag) hozzáadásával indítottuk el. A fibrinképződést (azaz a vérrögképződést) 1 órán keresztül 37°C-on követtük nyomon a 405 nm-es hullámhosszon mért optikai sűrűség mérésével SpectraMax i3 mikrolemezdetektorral (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).